本文引用格式：夏艳洁，焦智慧，吴庆华，等.两个肢带型肌营养不良2D型家系SGCA基因遗传分析和产前诊断[J].中华围产医学杂志,,23(3):-.DOI：10./cma.j.cn--
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夏艳洁 焦智慧 吴庆华 孔祥东
医院遗传与产前诊断中心
通信作者：孔祥东，Email：kongxd
.net，-肢带型肌营养不良（limb-girdlemusculardystrophy,LGMD）是一组临床表型和遗传方式均具有高度异质性的神经肌肉病，常以骨盆带及肩胛带肌肉无力、萎缩为首发症状，逐渐出现全身的肌肉无力和萎缩，发病率约为1/。根据遗传学特点，分为LGMDl型（即常染色体显性遗传）和LGMD2型（即常染色体隐性遗传）两大类型，其中LGMD1型仅有8个亚型（LHMD1A~1H）。临床上以LGMD2型较为常见，占全部LGMD的90%。根据致病基因的不同，LGMD2型又可以分为LGMD2A~2Z，共26种亚型[1]，其中LGMD2C~2F又被称为肌聚糖病[2]，分别由编码α、β、γ、δ-肌聚糖蛋白的基因突变所致。肌聚糖病的临床表现相似，根据肌肉病理结果难以鉴别分类[2-3]。但基于基因突变分析的分子遗传学诊断不仅可准确地对疾病进行诊断、分型，还可为高风险家系再次生育进行指导。基因靶向测序技术，可通过对基因组中目标区域进行捕获并富集，进一步使用Illumina等测序平台进行高通量测序，通过生物信息学分析对疾病进行鉴别诊断。本研究报道2例LGMD2D型患儿的临床表现、影像学、肌电图、肌肉病理学特点，并通过高通量靶向测序技术对患儿进行基因突变分析，明确遗传学病因后，患儿母亲再次妊娠时，通过对胎儿羊水细胞进行基因检测，为家系提供咨询与指导。一、病历资料
1.家系1：先证者，男性，汉族，10岁，于年6月因“运动发育迟缓8年”就诊于医院。患儿于1岁半开始行走，且走路、跑跳均较同龄儿童慢，蹲起、登爬楼梯费力，但无麻木或疼痛感，上述无力症状呈缓慢进行性加重。双上肢肌力5级，双下肢近端肌力4级，远端5级，Gowers征阳性。神经系统检查示：双侧肱二头肌、肱三头肌肌腱和双跟腱反射对称减低，双侧Babinski征、Kernig征和Hoffmann征均未引出。实验室检查：肌酸激酶U/L，肌酸激酶同工酶U/L，乳酸脱氢酶U/L，丙氨酸转氨酶70U/L，天冬氨酸转氨酶U/L，其余未见明显异常。肌电图显示：左侧上下肢呈周围神经性损害（脱髓鞘伴轴索损害）合并肌源性损害（以肢体近端为主），所测感觉神经均呈完全受损。肌肉MRI检查示：双侧臀大肌及大腿肌肉有脂肪浸润。肱二头肌活检显示：HE染色示肌纤维直径为10~60μm，可见大量变性、坏死和再生纤维，结缔组织中度增生，肌原纤维网轻度紊乱；（还原型）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide,NADH）脱氢酶、琥珀酸脱氢酶（succinatedehydrogenase,SDH）细胞色素C氧化酶活性在变性纤维中局灶性减低；一磷酸腺嘌呤核糖核苷酸（adenosinemonophosphate,AMP）染色酶活性正常，变性肌纤维中酸性磷酸酶活性升高；三磷酸腺嘌呤核苷（adeninetriphosphate,ATP）酶染色可见两型（Ⅰ、Ⅱ型）肌纤维基本呈镶嵌排列；肌纤维糖原正常，脂肪轻度升高；免疫组织化学染色显示全部肌纤维膜上抗肌营养不良蛋白-C、-N、-R蛋白染色显示多数肌纤维膜表达下降，抗α、β、γ、δ-肌聚糖蛋白均完全消失，诊断为LGMD。先证者母亲32岁，孕2产1，此次孕19周。2.家系2：先证者，男性，汉族，8岁，于年1月因“运动发育迟缓5年，进行性加重2年”就诊于医院。患儿于1岁7个月开始行走，走路缓慢，跑跳困难，登爬楼梯费力，但无麻木或疼痛感。翼状肩，双上肢肌力4级，双下肢近端肌力4级，远端5级，Gowers征阳性。神经系统检查示：双侧肱二头肌、肱三头肌肌腱和双跟腱反射对称减低，双侧Babinski征、Kernig征和Hoffmann征均未引出。实验室检查：肌酸激酶00U/L，肌酸激酶同工酶U/L，乳酸脱氢酶U/L，丙氨酸转氨酶85U/L，天冬氨酸转氨酶U/L，其余未见明显异常。肌电图显示：神经传导速度正常，呈肌源性损害。肌肉MRI检查提示：双侧臀大肌及大腿肌肉有弥漫脂肪浸润。肱二头肌活检显示：HE染色示部分肌纤维肥大变圆，直径最大75μm，有少数散在及呈灶状分布的坏死肌纤维，肌纤维未见分裂、环状、空泡改变及核内移/聚集现象，肌束衣内结缔组织中度增生。改良Gomori三色（modifiedGomoritrichrome,MGT）染色显示个别肌纤维膜下略红染；油红O染色显示少数肌纤维内脂肪滴明显增多；过碘酸-雪夫（periodicacid-Schiff,PAS）染色显示坏死纤维浅染。ATP酶染色可见两型肌纤维呈棋盘格样分布，肥大、萎缩肌纤维累及两型肌纤维；SDH染色可见个别破碎蓝纤维，未见强阳性血管；抗肌营养不良蛋白-N蛋白染色显示少数肌纤维膜阴性表达，其余阳性表达；抗肌营养不良蛋白-R、-C蛋白染色显示少数肌纤维膜表达下降，抗α、β-肌聚糖蛋白完全消失，抗γ、δ-肌聚糖蛋白表达下降，诊断为LGMD。先证者母亲31岁，孕2产1，此次孕19周。上述2例先证者均系足月顺产，无缺氧窒息史，出生后哭声响亮，吮吸有力。患儿神清语利，发育正常。心脏彩超显示心脏形态和结构未见明显异常，且左心室收缩和舒张功能正常；脊柱和四肢无畸形，各椎体无压痛，双下肢无水肿，全身肌肉无萎缩。2例先证者父母体健，非近亲婚配，否认家族神经肌肉病遗传史。为明确先证者病因及预防此类患儿再次出生，2个家系就诊于本院进行LGMD相关基因检测，并对胎儿行产前诊断。本研究经医院医学伦理委员会批准（批号：KS--KY-36），基因遗传学诊断均取得患儿家属的同意并签署知情同意书。二、研究方法
1.DNA提取：采集先证者及其父母外周血2~3ml置于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用美国OMEGA的基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，操作步骤按照说明书进行。DNA提取后，采用美国GEHealthcare公司的超微量分光光度计测定DNA的浓度和纯度，A/A值在1.8~2.0之间符合标准，保存于－20℃。2.高通量测序和数据分析：采用外显子捕获芯片结合Illumina测序平台，针对21个LGMD相关基因的外显子及其相邻内含子（约50bp）进行高通量测序，测序平均深度大于×。运用Burrows-WheelerAligner（BWA）软件与hg19比对得到所有变异位点，通过SOAPsnp和GenomeanalysisToolkit（GATK）软件鉴别SNP和Indel位点。3.突变命名和验证：对检测到的碱基变异在Hapmap数据库、千人基因组数据库、dbSNP数据库及ESP数据库中进行分析，排除已知多态性位点。通过检索人类基因突变数据库（HumanGeneMutationDatabase,HGMD；
